Мишина Анастасия. Определение пестицидов методом поляризационного флуоресцентного иммуноанализа

Научный руководитель — Л.И. Мухаметова, ХФ МГУ

Мишина презентация

Аристолохиевая кислота – под этим названием обычно подразумевают вещества, являющиеся производными 3,4-метилендиокси-10-нитро-1-фенантренкарбоновой кислоты, которые содержатся во всех растениях рода Aristolochia. Аристолохиеваякислота является мощным нефротоксином и канцерогеном (вызывает рак почек), приводит к множественным некрозам. В настоящее время болезнь, вызываемая АК, носит название нефропатия аристолохиевой кислоты или балканская эндемическая нефропатия. Воздействие АК было классифицировано Международным агентством по изучению рака ВОЗ в 2002, как канцероген 1 класса. Но тем не менее из-за недооцененности пагубного влияния травы, содержащие аристолохиевую кислоту, продолжают добавлять в фармацевтические средства. В связи с этим целью нашей работы было предложить чувствительный и быстрый метод скрининга аристолохиевой кислоты в анализируемой пробе (травяном сборе). Задачей являлось определение концентрации канцерогена методом поляризационно-флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА).

ПФИА – это гомогенный иммунохимический метод определения веществ с использованием флуоресцентной метки, основанный на конкуренции определяемого вещества и трейсера (низкомолекулярного вещества, антигена, меченого флуорофором) за связывание со специфическими антителами и определения поляризации флуоресценции трейсера в составе иммунного комплекса.

Молекулы трейсера, способные флуоресцировать, поглощают поляризованный свет, энергия фотонов переводит их с основных уровней S0 на вышележащие колебательные уровни S1. Затем после колебательной релаксации (на которую тоже тратится часть энергии) молекула испускает избыточную энергию в виде излучения с определённой длинной волны. Так как при возбуждении молекула поглощает поляризованный свет, то и испускание флуоресцирующего образца также поляризовано из-за того, что в поглощении участвуют лишь те молекулы, у которых вектор дипольного момента перехода имеет ненулевую проекцию на направление вектора напряженности электрического поля падающей волны.

Для проведения анализа смешивают растворы антител трейсера и антигенов. Между трейсером и антигеном происходит конкуренция за эпитоп антител. При фиксированной температуре и вязкости раствора значение поляризации флуоресценции зависит от эффективного размера молекулы флуорофора. Для небольших молекул, таких как трейсер, в растворе происходит сильное вращение вследствие броуновского движения, значит, испускаемый свет деполяризованный и ПФ низкая. Для крупных же молекул (трейсер + антитело) ПФ высокая. Таким образом если концентрации антител и трейсера одинаковые в ряде опытов, то поляризация ПФ зависит от концентрации антигенов. Если концентрация большая, то ПФ маленькая (так как мало трейсера свяжется с антителами), если концентрация маленькая, то ПФ большая (трейсер в большинстве своём связан с антителами).

Вертикально поляризованный свет, попадая в кювету, возбуждает флуорофор, который, возвращаясь в основное состояние, выделяет энергию в виде излучения. Данное излучение проходит через вертикально и горизонтально ориентируемые поляризаторы и затем регистрируется детекторами. С помощью полученных значений интенсивности излучения (Ih – интенсивность излучения, прошедшего через горизонтальный поляризатор; Iv – через вертикальный поляризатор) рассчитывается поляризация флуоресценции P, представляющая собой безразмерную величину:

P = (Iv — Ih) / (Ih + Iv)

Суммарная интенсивность флуоресценции при этом составляет:

I = 2Iv + Ih

Практическая часть:

1. Первостепенно было необходимо определить, за какое время происходит полное связывание антител с трейсером (значение ПФ перестаёт меняться). Для этого приготовили рабочий раствор трейсера.

2. К 4 мкл антител прибавляем 0,5 мл рабочего раствора и 0,5мл BB. На основание полученных данных был построен график в Sigma Plot и был сделан вывод, что время инкубации реакции 30 минут.

3. Далее необходимо было построить градуировочный график: в восемь пробирок добавляем по 500 мкл рабочего раствора трейсера и 500 мкл рабочего раствора AB (рабочий раствор – раствор препарата в BB), а затем по 50 мкл раствора аристолохиевой кислоты в 30% MeOH с разной концентрацией ( 0; 0,1; 0,03; 0,1; 0,3; 1; 10; 50 мкг/мл). После чего, выждав 30 минут, снимаем данные и строим график в Sigma Plot. По этому графику далее определяли концентрацию анализируемых растворов.

4. Теперь для определения концентрации аристолохиевой кислоты в травяном сборе и чае с кирказоном мы готовим пять пробирок, в которых разведение анализируемых растворов 1; 100; 500; 1000; 2000 кратное, разводим в 30% MeOH. Затем добавляем по 500 мкл рабочего раствора трейсера и 500 мкл рабочего раствора AB (рабочий раствор – раствор препарата в BB). На основании градуировочного графика определяем концентрации канцерогена. В травяном сборе содержание аристолохиевой кислоты не выявлено, а в чае с кирказоном оно составило 1,2 мкг/мл.

Литературные источники:

Перейти к содержимому